gb 31614.1-威尼斯37266

中华人民共和国国家标准

 gb 31614.1-2023

食品安全国家标准 食品中唾液酸的测定

前言

  本标准代替gb/t 30636-2014《燕窝及其制品中唾液酸的测定 液相色谱法》。

  本标准与gb/t 30636-2014相比，主要变化如下：

  ——修改了标准名称；

  ——修改了方法的适用范围，增加了液态乳、乳粉、糕点、饮料；

  ——明确了燕窝及其制品中测定的目标物质为结合态唾液酸；

  ——增加了液相色谱-荧光检测法和液相色谱-质谱/质谱法。

1范围

  本标准规定了食品中唾液酸的测定方法。

  本标准第一法液相色谱紫外检测法适用于燕窝及其制品中结合态唾液酸的测定，第二法液相色谱荧光检测法和第三法液相色谱质谱/质谱法适用于液态乳、乳粉、糕点、饮料中唾液酸的测定。

第二法 液相色谱-荧光检测法

9原理

  样品在盐酸溶液中加热水解，释放出唾液酸，提取液经固相萃取柱净化后，与邻苯二胺反应生成荧光衍生物，样品试液用反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。

10 试剂和材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。

10.1试剂及材料

10.1.1乙腈（ch3cn）： 色谱纯。

10.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。

10.1.3磷酸（h3po4）：色谱纯。

10.1.4四氢呋喃（c4h8o）：色谱纯。

10.1.5 浓盐酸（hcl）：12 mol/l。

10.1.6 邻苯二胺盐酸盐（c6h8n2·2hcl）。

10.1.7 三氯甲烷（chcl3）。

10.1.8 含极性基团的反相聚合物固相萃取柱：60 mg，3 ml，或相当者。含极性基团的反相聚合物固相萃取柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按照一定比例聚合成的大孔聚合物。

10.1.9微孔滤膜：0.45 μm，有机相型。

10.2试剂配制

10.2.1盐酸溶液（0.05 mol/l） ：吸取4.17 ml浓盐酸，溶于水并稀释至1 000 ml。

10.2.2 乙腈-水溶液（1 9）：将乙腈和水按1 ： 9的体积比混合均均。

10.2.3邻苯二胺盐酸盐溶液（50mg/ml）：称取2.5g邻苯二胺盐酸盐，加入50ml 0.05mol/l盐酸溶液溶解，混匀，现用现配。

10.2.4 0.2%磷酸溶液：吸取2 ml磷酸，溶于水并稀释至1 000 ml。

10.3 标准品

  唾液酸（n-乙酰神经氨酸，c11h19no9，cas号131-48-6）：纯度≥96%，或经国家认证授予标准物质证书的标准品。

10.4标准溶液配制

10.4.1唾液酸标准储备液（1000mg/l）：准确称取适量唾液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并配制成质量浓度为1 000 mg/l的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。

10.4.2唾液酸标准系列工作液：分别吸取唾液酸标准储备液（1000 mg/l）0.2 ml、1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml、10.0 ml和20.0 ml于100 ml容量瓶中，用乙腈-水溶液（1 9）定容至刻度，混匀。唾液酸标准系列工作液的质量浓度分别为2.0 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l、40.0 mg/l、100.0 mg/l和200.0 mg/l，临用现配。

11仪器和设备

11.1 液相色谱仪：配有荧光检测器。

11.2恒温水浴锅。

11.3 涡旋混合器。

11.4 分析天平：感量为0.1 mg和0.01 g。

11.5 匀浆机：转速不低于10 000 r/min。

11.6 高速离心机。

12分析步骤

12.1 样品前处理

12.1.1试样制备

  液态试样摇匀；基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于下一步试样提取；其他试样需匀浆或粉碎均匀。

12.1.2试样提取

  称取1 g（精确至0.01 g）样品于25 ml具塞比色管中（固体样品先加入3 ml水，涡旋振荡30 s），沿管壁缓慢加入10 ml盐酸溶液，一边加一边振荡，盖上玻璃塞，涡旋混匀，置于80℃水浴中水解40 min，在水浴过程中每5 min振荡一次。取出比色管，冷却至室温，用乙腈-水溶液（1 9）定容至25 ml，混匀，静置5 min。取10 ml上层溶液放入离心管中，加入5 ml三氯甲烷，涡旋混匀后，9000 r/min离心5 min，取上清液待净化。

12.1.3 试样净化

  固相萃取柱依次用3 ml甲醇和3 ml水活化，负压抽干，样液以小于1 ml/min 的流速通过固相萃取柱，收集流出液，过0.45 μm微孔滤膜后，待衍生化。

12.1.4 衍生化

  准确吸取1.0 ml样液于10 ml具塞比色管中，准确加入1.0 ml邻苯二胺盐酸盐溶液，盖上玻璃塞，混匀，置于80℃水浴中反应35 min，取出比色管，冷却至室温，过0.45 μm微孔滤膜后，待测。

  同时做唾液酸标准系列工作溶液的衍生化，衍生后标准系列工作溶液的质量浓度分别为1.0mg/l、5.0 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l、50.0 mg/l和100.0 mg/l。

12.2液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a）色谱柱：c18柱，250 mm×4.6 mm（内径），5μm，或相当者。

b）柱温：30℃。

c）荧光检测器激发波长：235 nm，发射波长：414 nm。

d）流速：1.0 ml/min。

e）进样量：10 μl。

f）流动相：a相：950 ml 0.2%磷酸溶液 50 ml四氢呋喃；b相：甲醇。梯度洗脱，见表1。

12.3 标准曲线的制作

  将衍生后的标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中唾液酸的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。唾液酸标准溶液的色谱图参见附录b中图b.1。

12.4试样溶液的测定

  将衍生后的试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中唾液酸的质量浓度。标准工作液和待测样液中唾液酸的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线线性范围，需调整称样量或定容体积重新检测。

13分析结果的表述

试样中唾液酸的含量按式（2）计算。

式中：

x——试样中唾液酸的含量，单位为克每千克（g/kg）；

ρ——由标准曲线得到的试样溶液中唾液酸的质量浓度，单位为毫克每升（mg/l）；

v——试样的定容体积，单位为毫升（ml）；

f——稀释倍数；

m——试样的取样量，单位为克（g）；

1000——换算系数。

计算结果需扣除空白值，保留3位有效数字。

14 精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

15其他

  称样量为1 g时，唾液酸的检出限为0.02 g/kg，定量限为0.05 g/kg。